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一、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
根據(jù)客戶的預(yù)期蛋白量、純度以及蛋白用途等需求，通過哺乳系統(tǒng)來分泌表達(dá)純化目的蛋白。設(shè)計(jì)思路為：密碼子優(yōu)化最適宜哺乳系統(tǒng)的基因序列，將目的蛋白序列構(gòu)建到普健生物自主研發(fā)的高效表達(dá)載體pATX2，N端添加哺乳系統(tǒng)常用信號肽利于分泌表達(dá)，C端添加His標(biāo)簽，便于蛋白的檢測和親和純化，瞬時轉(zhuǎn)染哺乳細(xì)胞HEK293，通過SDS-PAGE檢測蛋白表達(dá)情況，收集培養(yǎng)基部分用鎳柱親和純化獲得目的蛋白。
二、蛋白性質(zhì)分析
2.1信號肽分析
2.2疏水性分析
2.3跨膜結(jié)構(gòu)域分析
綜上所述：
1.目的蛋白理論分子量為 43KDa，適宜表達(dá)。
2.對蛋白的信號肽，跨膜結(jié)構(gòu)域和親疏水性分析，蛋白整體疏水性略強(qiáng)。
3.目的蛋白自身無信號肽，添加哺乳系統(tǒng)常用信號肽，利于蛋白分泌表達(dá)。
4.在C端添加His標(biāo)簽，便于蛋白的檢測和親和純化。
三、實(shí)驗(yàn)方法
3.1 轉(zhuǎn)染前一天，接種細(xì)胞到完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞在轉(zhuǎn)染當(dāng)天處于對數(shù)生長期。
3.2 轉(zhuǎn)染復(fù)合物的準(zhǔn)備。
3.3 轉(zhuǎn)染：加入轉(zhuǎn)染混合物到細(xì)胞懸液中，輕柔混勻后培養(yǎng)至細(xì)胞活率降到50%以下收樣。
3.4 收集表達(dá)后的細(xì)胞液，將培養(yǎng)基上清標(biāo)記為culture medium;細(xì)胞加入1×PBS混勻，超聲后離心，上清吸至新的EP管中，標(biāo)記為NPE，沉淀加入1×PBS(含8M尿素)，混勻，標(biāo)記為DPE。
3.5 鎳柱親和純化：
3.5.1 用PBS，pH 7.5緩沖液平衡鎳柱，以0.5 ml/min流速上樣;
3.5.2 用Wash-Buffer以1 ml/min流速沖洗;
3.5.3 用Elution-Buffer以1 ml/min流速洗脫目的蛋白，收集流出液;
3.5.4 將上述收集的蛋白溶液放入透析袋中，使用PBS(pH 7.5)進(jìn)行透析過夜;
3.5.5 進(jìn)行SDS-PAGE分析。
四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
4.1 蛋白鎳柱親和純化樣品SDS-PAGE分析：
4.2純化后樣品濃縮透析之后進(jìn)行SDS-PAGE分析：
結(jié)論：目的蛋白已成功表達(dá)純化，并且純化得到的蛋白純度較高，在90%以上。
五、樣品信息
| 蛋白 | 濃度 | 規(guī)格 | 數(shù)量 | 總量 |
| 重組蛋白A | 2.5 mg/ml | 1.00 ml/vial | 2 vials | 5.00 mg |
六、結(jié)論
目的蛋白表達(dá)量為62.5 mg/L, 純度大于90%。
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