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抗原特異性B細(xì)胞群體是發(fā)現(xiàn)治療性單克隆抗體（mAb）的關(guān)鍵資源，源自自然感染的人類或人工免疫后的動(dòng)物（包括小鼠、大鼠、雞、兔和羊駝），這些細(xì)胞大多從供體血液樣本或免疫后的小鼠脾臟中分離。今天，小編將帶領(lǐng)大家一起深入探究這些常規(guī)單克隆抗體生產(chǎn)技術(shù)，了解它們是如何從實(shí)驗(yàn)室走向世界的每一個(gè)角落，成為守護(hù)健康的強(qiáng)大武器。
雜交瘤技術(shù)
由1984年諾貝爾獎(jiǎng)得主Cesar Milstein和Georges Kohler于1975年創(chuàng)立，成為了1986年美國食品和藥品監(jiān)督管理局（FDA）核準(zhǔn)的第一個(gè)抗體Muromonab-CD3（商品名OKT3）的孵化搖籃。此技術(shù)的核心在于運(yùn)用電融合法或化學(xué)介導(dǎo)的融合，使原初B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞（一種B細(xì)胞惡性腫瘤細(xì)胞系）結(jié)合，實(shí)現(xiàn)B細(xì)胞的永生化。雜交瘤技術(shù)的一個(gè)潛在缺點(diǎn)是細(xì)胞融合過程的效率有限。融合后，單個(gè)B細(xì)胞克隆通常通過有限的稀釋進(jìn)行劃分。連續(xù)分泌IgG的克隆細(xì)胞允許對未純化的細(xì)胞上清進(jìn)行中等通量篩選，以鑒定具有所需結(jié)合活性的克隆，例如，利用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）進(jìn)行親和性驗(yàn)證。雜交瘤技術(shù)之所以吸引人是因?yàn)樗Ａ粝铝嗽镜腣H/VL配對，且在治療性抗體應(yīng)用方面取得了成功?，F(xiàn)有多款出自雜交瘤的單克隆抗體獲得了FDA的認(rèn)可，成為市場上的治療藥物。該技術(shù)主要用于小鼠、大鼠和兔子的B細(xì)胞永生化。為了鑒定全人抗體候選物，XenoMouse、HuMab-mouse和Alloy-GKmouse等轉(zhuǎn)基因小鼠模型也為傳統(tǒng)雜交瘤技術(shù)提供了有價(jià)值的B細(xì)胞來源，并分離出了經(jīng)FDA批準(zhǔn)的單克隆抗體?？傮w而言，雜交瘤技術(shù)仍然是挖掘治療性IgG的常見和可靠途徑。
單B細(xì)胞篩選
單B細(xì)胞篩選作為雜交瘤技術(shù)的有力替代，標(biāo)準(zhǔn)化的篩選流程包括：B細(xì)胞首先通過磁珠分選（MACS）進(jìn)行富集，根據(jù)細(xì)胞標(biāo)記物標(biāo)記抗原和抗體進(jìn)行正性和負(fù)性選擇，確保僅選取那些表達(dá)了目標(biāo)抗原或抗體的細(xì)胞。隨后，采用熒光激活細(xì)胞分選（FACS）技術(shù)，精確無誤地每孔一個(gè)細(xì)胞，為了提取并解析完整的VH/VL基因?qū)?，將?xì)胞內(nèi)的RNA通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）轉(zhuǎn)換成cDNA形式，再通過PCR針對性擴(kuò)增VH與VL編碼區(qū)，生成足夠數(shù)量的基因模板，進(jìn)行Sanger測序，優(yōu)選出的IgG隨即被克隆，表達(dá)，純化，最終篩選所需的生物學(xué)以及生物物理性質(zhì)。創(chuàng)新微流控技術(shù)更是讓單細(xì)胞水平的RT-PCR成為可能，一個(gè)流式細(xì)胞儀分選的抗原特異性B細(xì)胞池被劃分為每個(gè)微滴中的一個(gè)細(xì)胞，從而可以在微滴中進(jìn)行小型化的RT-PCR，繼而通過二代測序和BCR分析篩檢候選抗體IgG。對比雜交瘤，單B細(xì)胞篩選省去了細(xì)胞融合環(huán)節(jié)，避免了每十萬細(xì)胞中只有一個(gè)存活分泌抗體B細(xì)胞的局限。
表面展示技術(shù)
除傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)和單B細(xì)胞篩選外，體外表面展示技術(shù)，特別是噬菌體和酵母展示，成為高通量篩選抗體片段的有力工具。
噬菌體展示：最早也是最廣泛應(yīng)用的形式之一，利用噬菌體作為展示載體，將肽段或蛋白質(zhì)插入噬菌體外殼蛋白的基因中，使目的肽與噬菌體顆粒的表面展示出來。這一方法可用于篩選抗體、激酶抑制劑等。
酵母展示：使用釀酒酵母或其他真核微生物作為宿主，展示出來的蛋白質(zhì)更接近天然構(gòu)象，適合篩選具有復(fù)雜折疊和糖基化修飾的蛋白質(zhì)，如抗體。
細(xì)菌展示：通過改造細(xì)菌如大腸桿菌的膜蛋白，使目的蛋白在細(xì)胞表面表達(dá)，適用于高通量篩選和蛋白質(zhì)工程。
體外表面展示技術(shù)不僅適用于抗原經(jīng)驗(yàn)豐富的抗體庫，還適用于原始抗體庫的篩選。后者的一個(gè)顯著優(yōu)點(diǎn)在于避免了構(gòu)建完整免疫應(yīng)答所需耗時(shí)（數(shù)周乃至數(shù)月），這一點(diǎn)在應(yīng)對傳染病時(shí)尤為重要。相比而言，從原始基因庫（>10^10變異體）中篩選，更能迅速獲取高親和力抗體。篩選大規(guī)模、多樣化的原始庫，分離出的克隆親和力通常與文庫規(guī)模呈正相關(guān)，顯示出在傳染病治療性抗體發(fā)現(xiàn)中的實(shí)用性，如針對SARS-CoV-2的情況所示。
相較于雜交瘤技術(shù)和單細(xì)胞篩選，表面展示技術(shù)因其易于進(jìn)行多次循環(huán)篩選的特點(diǎn)，能有效精選出高親和力、高選擇性的克隆。多項(xiàng)FDA批準(zhǔn)的單克隆抗體，如著名藥物Humira（阿達(dá)木單抗），正是得益于此類技術(shù)而得以發(fā)現(xiàn)。
從雜交瘤到單細(xì)胞技術(shù)，再到表面展示，每一階段都為抗體發(fā)現(xiàn)開辟新徑，促進(jìn)免疫學(xué)研究與治療性抗體開發(fā)。
