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大腸桿菌原核蛋白表達的操作步驟和相關(guān)注意事項

發(fā)表時間:2024-04-03 訪問次數(shù):1273

  采用大腸桿菌表達蛋白是現(xiàn)階段使用非常廣泛的一項技術(shù),我們一般將這種方法稱為原核表達。這個方法的使用范圍非常的廣泛,比如在蛋白純化、定位以及相關(guān)蛋白功能分析等。因為大腸桿菌易于控制和生長,而且價格相對便宜,使得其使用極為廣泛。

大腸桿菌表達系統(tǒng)

  大腸桿菌蛋白表達時,常常會使用載體(通常為質(zhì)粒)來表達目的蛋白。原核表達通常按照:獲得目的蛋白、構(gòu)建表達載體、插入目的基因、培養(yǎng)宿主菌、誘導(dǎo)蛋白表達、蛋白分析,最后通過擴增、純化等操作后,進行進一步檢測;

  其具體操作步驟如下:

  1、獲得目的基因

  獲得目的基因的方法主要有兩種,一種是PCR方法,一種是RT-PCR方法,另外一種是人工合成法。

  PCR法:以含有目的基因的克隆質(zhì)粒為模板,通過基因序列設(shè)計一對引物,從而獲得基因片段;

  RT-PCR法:從細胞或組織中提取RNA,而后以RNA逆轉(zhuǎn)錄出cDNA第一鏈,而后以逆轉(zhuǎn)錄為模板獲得目的基因;

  人工合成法:通過檢測到的目的基因序列,合成重疊的單鏈寡合苷酸,而后通過重疊延伸PCR法拼接出全長;

  2、構(gòu)建表達載體

  使用限制性內(nèi)切酶將質(zhì)粒進行雙酶切,而后對酶切的產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳,從而獲得載體大片段,而后通過相關(guān)技術(shù)手段將目的基因連入載體;

  3、質(zhì)粒構(gòu)建

  將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌,而后對相關(guān)細菌進行挑選,再然后通過裂解法提取質(zhì)粒,最后檢測目的基因的插入方向并論證其正確性;

  4、誘導(dǎo)表達

  對含有目的基因的菌體進行培養(yǎng),而后取部分液體與未誘導(dǎo)組進行對照,培養(yǎng)完成后,離心后取上清液作為樣品;

  大腸桿菌蛋白表達的注意事項有哪些?

  1、在我們選擇表達載體時,一定要根據(jù)蛋白的最終應(yīng)用來進行選擇;

  2、在進行外源DNA連接時,需要確保其轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)移過程中不會出現(xiàn)相互干擾的情況;

  大腸桿菌蛋白表達作為現(xiàn)階段使用最為廣泛的原核蛋白表達系統(tǒng),因為其遺傳背景清晰的優(yōu)勢,在蛋白表達上有著極大的優(yōu)勢。在進行相關(guān)蛋白表達時,需要嚴格按照實驗標準來操作,這樣才能在更大程度上保證蛋白的表達。武漢普健生物專業(yè)為廣大用戶提供原核蛋白表達服務(wù),如果您有相關(guān)需求,歡迎來電咨詢。