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重組抗體表達

普健生物自有的哺乳表達系統(tǒng)高產(chǎn)量pATX系列載體及馴化293系列和CHO系列細胞，能實現(xiàn)全長抗體以及多種形式的重組抗體片段的高效分泌表達；無需免疫和篩選，直接利用抗體基因序列即可實現(xiàn)重組抗體的高產(chǎn)和可重復生產(chǎn)。

諸多表達優(yōu)勢

1. 抗體藥物研發(fā)專家和技術團隊，提供個性化抗體發(fā)現(xiàn)整體方案，重組抗體表達量高，采用高密度轉染，可實現(xiàn)瞬轉表達量幾百毫克每升，穩(wěn)轉可優(yōu)化到克級。

2. 抗體表達經(jīng)驗豐富，已成功表達過多種形式的全長抗體（Human IgG, mouse IgG, human Ig A, IgM, IgE, mouse IgM，rabbit IgG 等）和抗體片段（scFv，F(xiàn)ab，tandem-scfv，VHH，F(xiàn)c融合蛋白，bi-specific antibody等）。

3. 一站式服務：擁有多種服務平臺，在實現(xiàn)重組抗體設計表達和純化的同時，進行抗體質控和活性驗證，并由經(jīng)驗豐富的專家根據(jù)客戶需求進行人源化設計驗證。

4. 自主知識產(chǎn)權的GS敲除系統(tǒng)細胞系，長期穩(wěn)定表達，抗體質量更穩(wěn)定。

5. 周期短，可提供2~3周急速交付重組抗體表達服務。

抗體的結構及多樣化過程

典型的抗體分子由重鏈和輕鏈組成，形成的免疫球蛋白結構域又可以分為可變區(qū)和恒定區(qū)，分別負責抗原的結合和下游免疫反應的激活。

在B細胞發(fā)育早期階段，編碼可變區(qū)的V元件、J元件，以及重鏈可變區(qū)特有的D元件，可以通過核酸內切酶RAG起始的V(D)J重排進行組合和連接從而形成可變區(qū)基因外顯子，所分泌的低親和力IgM抗體構成了初始的抗體庫。在外周淋巴組織結構生發(fā)中心中，B細胞特異性DNA去氨酶AID能夠起始可變區(qū)高頻突變和重鏈恒定區(qū)抗體類型轉換，從而形成了表達高親和力不同抗體類型的抗體庫。

圖片1.png

典型的抗體分子和抗體多樣化過程

體類型轉換的分子機制

抗體類型轉換是抗體多樣化過程中的重要一步，其產(chǎn)生的不同類型抗體能夠激活不同的下游免疫反應。

B細胞特異性DNA去氨酶AID起始了這一過程，產(chǎn)生的DNA斷裂則由細胞內DNA損傷修復系統(tǒng)進一步連接完成整個過程。遺傳學證據(jù)清晰地表明，抗體類型轉換由兩步組成：第一步，AID介導的雙鏈DNA斷裂的產(chǎn)生；第二步，雙鏈DNA斷裂激活DNA損傷應答機制將兩個雙鏈DNA斷裂連接起來。

1. AID靶向基因組DNA底物引起雙鏈DNA斷裂的機制

圖片2.png

A：AID去氨基酶活性示意圖。AID作用于N4位點，能夠將單鏈DNA上的胞苷(C)殘基脫氨產(chǎn)生尿苷(U)；B、C、D：基因組轉錄過程中產(chǎn)生的轉錄泡、負超螺旋結構以及R-環(huán)可以提供單鏈DNA招募AID；深色線條和淺色線條分別代表DNA雙鏈的模板鏈和非模板鏈，紅線代表RNA轉錄產(chǎn)物。E：AID相互作用因子RPA復合物和RNA外切體復合物能夠為AID提供單鏈DNA底物。F：對向轉錄招募AID到非免疫球蛋白基因靶點：藍線代表轉錄, 紅線代表反轉錄。

2. 雙鏈DNA損傷修復與S區(qū)斷裂末端連接

抗體類型轉換中產(chǎn)生的S區(qū)的雙鏈DNA斷裂的修復，并不依賴于AID去氨酶活性。AID起始形成S區(qū)的雙鏈DNA斷裂可以激活細胞內通用的雙鏈DNA損傷應答系統(tǒng)，最終非同源DNA末端連接系統(tǒng)將兩個S區(qū)斷裂連接起來。

DNA末端修復連接途徑

A: ATM依賴的雙鏈DNA損傷應答機制。MRN復合體可以識別DSB末端招募ATM并激活ATM激酶活性, 使多種下游蛋白包括H2AX、53BP1等發(fā)生磷酸化。磷酸化的H2AX即γ-H2AX可以進一步招募其他雙鏈DNA損傷應答因子MDC1, RNF8能夠與磷酸化的MDC1相互作用, 并泛素化修飾組蛋白H1。RNF168可以識別組蛋白H1泛素化修飾, 并進一步泛素化修飾組蛋白H2A。53BP1識別組蛋白H2A泛素化修飾而進一步招募至DNA損傷位點。ATM磷酸化的53BP1能夠招募Rif1進一步抑制由CtIP介導的雙鏈DNA末端的單鏈切除, 從而使DNA斷裂末端更容易被非同源DNA末端連接途徑修復并同時抑制同源重組的發(fā)生。B:在c-NHEJ過程中,Ku結合至DSB末端, DNA-PKcs被進一步招募至DNA的DSB上,XRCC4/Lig4復合物最終連接兩個末端。A-EJ途徑中, PARP1可能參與了對DSB的識別, Mrel 1和CtIP可能介導末端連接, 最終由Lig1或Lig3進行末端連接。

重組抗體表達的相關研究進展

抗體產(chǎn)生和多樣化過程的缺陷在臨床上表現(xiàn)為各種免疫缺陷疾病，而抗體多樣化的失控則可能造成B細胞淋巴瘤的產(chǎn)生。

抗體多樣化中，抗體基因在基因組水平面臨DNA修飾和損傷的發(fā)生。這種DNA水平的損傷雖然受到精細地調控，但往往也造成了基因組的不穩(wěn)定性導致癌癥的發(fā)生。生發(fā)中心B細胞來源的B細胞淋巴瘤中，AID起始的DNA損傷產(chǎn)生的染色體易位、基因突變等是癌變的主要機制之一。研究AID靶向機制和抗體多樣化中DNA損傷修復機制，可以為生發(fā)中心來源的B細胞淋巴瘤，如濾泡型淋巴瘤、彌漫大B細胞淋巴瘤等，以及CLL的治療和診斷提供新的思路和技術手段。

目前我們對抗體多樣化機制的認識仍存在大量的空白，致力于抗體類型的研究從未停歇。通過基因工程對編碼抗體的基因按不同需要進行加工改造和重新裝配，轉染適當?shù)氖荏w細胞從而表達抗體，這種通過基因工程重組表達抗體的技術，現(xiàn)已廣泛應用于抗體藥物研究。

重組抗體的優(yōu)勢

重組抗體包括嵌合抗體、人源化抗體、小分子抗體、雙特異性抗體等。與傳統(tǒng)的單克隆抗體和多克隆抗體相比，重組抗體具有獨特的優(yōu)勢，現(xiàn)已被廣泛地應用在科學研究、免疫診斷及治療性抗體領域。在被廣泛應用的情況下，重組抗體表達技術水平也在日益提高，重組抗體除了以上優(yōu)勢之外還有以下一些優(yōu)點。

（1）重組抗體具有序列已知、抗體基因可以長期保存、抗體性能穩(wěn)定、實驗重復性好等優(yōu)點，而單克隆細胞株可能存在抗體染色體丟失、細胞復蘇后停止生長或死亡等風險。

（2）可以進行基因工程改造：重組抗體可以進行重組改造，包括抗體片段表達，同型置換，嵌合抗體，抗體人源化等。

（3）可以大量制備抗體：重組抗體可以快速實現(xiàn)抗體的大量制備，不需要使用動物，克服使用動物的倫理問題。

重組抗體表達及抗體多樣性形成機制