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上篇流式小課堂的第一期，我們帶大家簡單了解流式檢測平臺【第一期】流式小課堂。從本篇開始我們將以 step by step 的方式各個擊破關(guān)于流式實驗的相關(guān)難點。
我們知道流式細(xì)胞術(shù)是基于特定激光激發(fā)下，細(xì)胞產(chǎn)生的熒光被流式儀接收器接收。那么流式儀所接收的光信號一定就是應(yīng)該素被激發(fā)之后所產(chǎn)生的嗎？答案是否。這里我們要引入一個概念---非特異性熒光。所謂非特異性熒光是指：細(xì)胞表面的某些分子或者結(jié)構(gòu)能夠產(chǎn)生熒光，這種熒光相對于熒光素產(chǎn)生的熒光較弱，并且與細(xì)胞表面的特異抗原分子沒有相關(guān)性。由于非特異性熒光的存在，在特定激光激發(fā)下，細(xì)胞產(chǎn)生的熒光并不是絕對的有或者無，細(xì)胞表面不結(jié)合流式熒光素也會產(chǎn)生熒光信號。這就給我們分析流式結(jié)果時帶來了一定的難度，相當(dāng)于我們通過流式檢測時得到的熒光信號是細(xì)胞本身的非特異性熒光和來自于細(xì)胞表面結(jié)合的熒光素的特異性熒光疊加得到的結(jié)果。
陰性對照
由于存在光信號疊加，因此在分析流式結(jié)果時我們需要比較熒光信號與細(xì)胞的非特異性熒光。如果得到的熒光信號大于非特異性熒光，說明得到的熒光信號部分來源于熒光素的特異性熒光，就可以得出細(xì)胞表達(dá)相應(yīng)的抗原分子的結(jié)論。所以，確定與熒光素?zé)o關(guān)的細(xì)胞自身的非特異性熒光的強(qiáng)弱非常重要，設(shè)立陰性對照就是為了確定細(xì)胞的非特異性熒光。
上圖為3類陰性對照和標(biāo)記熒光素偶聯(lián)抗體(抗CD69-PE)得到的熒光信號的示意圖。相比于前面3類陰性對照，可以得出這群樣品細(xì)胞中有30％的細(xì)胞表達(dá)有CD69抗原分子。如果沒有陰性對照作為參照，直接根據(jù)最后標(biāo)記熒光素偶聯(lián)抗體組的熒光信號無法判斷樣品細(xì)胞中有多少比例的細(xì)胞表面結(jié)合有PE熒光素，從而也就無法判斷有多少比例的細(xì)胞表達(dá)CD69抗原分子。
第1類
negative
“negative”表示的是不加任何熒光素偶聯(lián)抗體時得到的熒光信號，因為沒有標(biāo)記任何熒光素，所以這組得到的熒光信號與熒光素?zé)o關(guān)，與細(xì)胞抗原分子是否表達(dá)無關(guān)，得到的熒光信號代表的是非特異性熒光信號；
第2類
抗CD69
“抗CD69”表示的是用抗CD69抗體標(biāo)記樣品細(xì)胞后得到的熒光信號，雖然抗CD69抗體能夠與細(xì)胞表面的CD69抗原分子結(jié)合，但是抗CD69抗體沒有偶聯(lián)熒光素，所以得到的熒光信號也與細(xì)胞表面是否表達(dá)有CD69分子無關(guān)，得到的熒光信號代表的也只是細(xì)胞本身的非特異性熒光，所以這種對照用于排除抗體的影響；
第3類
IgG1-PE
“IgG1-PE”表示的是標(biāo)記與抗CD69抗體同種屬（來源于同一物種）且同類（抗CD69-PE中的抗體是IgG1類的）的非特異性抗體（IgG1）與PE熒光素偶聯(lián)的同型（isotype）對照抗體（IgG1-PE）后，得到的熒光信號，這種同型對照抗體不能與細(xì)胞表面的CD69發(fā)生特異性結(jié)合，所以細(xì)胞表面不會結(jié)合有IgG1-PE，最后得到的熒光信號不是PE熒光素產(chǎn)生的特異性熒光信號，而是代表細(xì)胞本身的非特異性熒光，所以這種對照用于排除熒光素的影響。第3類同型對照抗體就是我們在流式實驗中最常設(shè)置的同型對照。
FMO對照
減一陰性對照（Fluorescence-minus-onecontrol，F(xiàn)MO對照）是一種特殊的陰性對照，是指在多色（通道）分析時對其中某一個通道特別設(shè)置的陰性對照，多在研究不同細(xì)胞亞群表達(dá)某些重要的表型分子、細(xì)胞因子等時應(yīng)用。
如需要研究人外周血單個核細(xì)（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）中CD62L+CD4+和CD62L-CD4+兩個細(xì)胞亞群表達(dá)CD45RA這個重要表型分子的表達(dá)情況時，需要同時標(biāo)記不同熒光素偶聯(lián)的抗人CD4、CD62L和CD45RA抗體，除了常規(guī)的陰性對照設(shè)置，最好再設(shè)置一組FMO對照，就是只標(biāo)記熒光素偶聯(lián)抗人CD4和CD62L抗體，而不標(biāo)記熒光素偶聯(lián)的抗人CD45RA抗體，然后將CD62L+CD4+和CD62L-CD4+細(xì)胞亞群分別設(shè)門，將兩群細(xì)胞分別顯示于新的散點圖中，散點圖上其中一個軸代表CD45RA的熒光信號，這時就可以分別設(shè)置這兩個細(xì)胞亞群CD45RA通道的陰陽性界線，然后再上樣分析實驗組，根據(jù)不同細(xì)胞亞群各自的陰陽性界線分別判定細(xì)胞亞群各自表達(dá)CD45RA的情況。這種特殊的陰性對照就是FMO對照。因為不同細(xì)胞亞群的非特異性熒光可能存在差異，而且不同細(xì)胞亞群結(jié)合有不同的熒光素偶聯(lián)抗體從而使它們的最佳補(bǔ)償值存在差異，當(dāng)在統(tǒng)一的補(bǔ)償條件下同時分析時，不同細(xì)胞亞群在某一通道的陰陽性界線就可能存在差異，普通陰性對照無法進(jìn)一步區(qū)分這種差異，而FMO對照就可以通過只缺少標(biāo)記這一通道代表的熒光素偶聯(lián)抗體，精確界定不同細(xì)胞亞群各自的這一通道的陰陽性界線，從而使流式分析結(jié)果更加精確。
陽性對照
說完了陰性對照，我們來講講陽性對照的設(shè)置。流式實驗的陽性對照，是指在使用某種熒光素偶聯(lián)抗體前先檢測該熒光素偶聯(lián)抗體是否有效。
陽性對照并不是每次流式分析時都必須設(shè)置，以下是需要設(shè)置陽性對照的情況，給大家參考判斷：
1.使用新的熒光素偶聯(lián)抗體時，該熒光素偶聯(lián)抗體以前沒有使用過。
2.換用不同公司的或者同一公司但不同批號的熒光素偶聯(lián)抗體時。
3.使用儲存時間較長的熒光素偶聯(lián)抗體時。
當(dāng)出現(xiàn)以上三種情況時，熒光素偶聯(lián)抗體會因為失效而導(dǎo)致無法與抗原分子結(jié)合產(chǎn)生特異性的熒光信號，從而得到一個假陰性的結(jié)果。
設(shè)置陽性對照通常我們使用以下兩種方法：
01
肯定表達(dá)有相應(yīng)抗原分子的樣品細(xì)胞來檢測，如檢測熒光素（不管哪種熒光素）偶聯(lián)的抗小鼠CD4抗體，可以用該抗體標(biāo)記正常小鼠的脾臟細(xì)胞，因為該細(xì)胞內(nèi)肯定有CD4陽性細(xì)胞，而且已知CD4陽性細(xì)胞占脾臟細(xì)胞的大致比例范圍，所以如果用該抗體標(biāo)記脾臟細(xì)胞得到意料中的結(jié)果時，就可以認(rèn)為該抗體有效；
02
如果實驗室有已證明有效地與待測熒光素偶聯(lián)抗體的單克隆抗體相同但偶聯(lián)的熒光素不同的熒光素偶聯(lián)抗體，如需檢測FITC偶聯(lián)的抗小鼠CD4抗體（FITC-CD4抗體）是否有效，實驗室已有證明有效的PE偶聯(lián)的抗小鼠CD4抗體（PE-CD4抗體），這時可以用這兩種熒光素偶聯(lián)抗體同時標(biāo)記同一份肯定表達(dá)有相抗原分子（CD4分子）的樣品細(xì)胞，流式檢測后如果PE陽性的細(xì)胞FITC也是陽性的，PE陰性的細(xì)胞FITC也是陰性的，就可以證明該待測的熒光素偶聯(lián)抗體有效。
以上就是關(guān)于流式實驗中對照設(shè)置的相關(guān)知識，下一篇我們將繼續(xù)介紹流式實驗如何選擇流式細(xì)胞術(shù)常用的熒光素。敬請期待~
關(guān)于普健
普健生物（AtaGenix）于2012年在武漢成立，作為武漢國家生物產(chǎn)業(yè)基地公共服務(wù)平臺—光谷抗體發(fā)現(xiàn)與篩選公共服務(wù)平臺。普健生物（AtaGenix）專注于重組蛋白、抗體、診斷原料、抗體藥物發(fā)現(xiàn)等自主技術(shù)平臺的建設(shè)和下游生物醫(yī)藥產(chǎn)品的戰(zhàn)略合作。經(jīng)過10年的發(fā)展，普健生物已成為一家立足武漢，業(yè)務(wù)覆蓋全國、輻射全球的高新技術(shù)服務(wù)企業(yè)。目前公司擁有4200平米自建實驗室（包含800平高標(biāo)準(zhǔn)BSL-2級細(xì)胞房），擁有齊全蛋白抗體開發(fā)設(shè)備500余套，包括高通量蛋白純化儀、Agilent 流式細(xì)胞分析儀，全自動HPLC分析儀，openSPR蛋白、抗體親和力測定儀，Olympus熒光顯微鏡， BTX電融合儀，微生物發(fā)酵罐，中試型高壓均質(zhì)機(jī)，全自動管式化學(xué)發(fā)光儀，以及配套的高速離心機(jī)，細(xì)胞計數(shù)儀及大容量細(xì)胞培養(yǎng)搖床。公司先后獲得榮譽：3551人才計劃、高新技術(shù)企業(yè)、技術(shù)先進(jìn)型服務(wù)企業(yè)、光谷瞪羚企業(yè)
