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上期推文《終于有人把主流的單抗開(kāi)發(fā)平臺(tái)總結(jié)清楚了?》中，小編和大家介紹了各種高效且目前主流的單抗開(kāi)發(fā)平臺(tái)，從本篇開(kāi)始，讓我們一起關(guān)注這些更具獨(dú)特性的抗體制備方法和抗體應(yīng)用方向。
泛素和泛素化
泛素(ubiquitin，Ub)是一種小分子多肽，由76個(gè)氨基酸組成并廣泛分布于真核細(xì)胞中。其主要功能是非底物特異性的標(biāo)記需要降解的蛋白質(zhì)，主要存在形式包括：游離的泛素、多泛素鏈、泛素化蛋白;不同形式存在的泛素含量反映了細(xì)胞的不同生理狀態(tài)。
不同類(lèi)型的泛素化
泛素化是指泛素分子在一系列特殊酶(如泛素激活酶、結(jié)合酶、連結(jié)酶、降解酶等)的作用下，將細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)進(jìn)行分類(lèi)，篩選出靶蛋白分子并對(duì)其進(jìn)行特異性修飾的過(guò)程。由于泛素化的多樣性與多價(jià)性，泛素化廣泛參與包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡、自噬、DNA損傷修復(fù)、免疫應(yīng)答等各種生理過(guò)程，是近年來(lái)生物化學(xué)研究的一個(gè)重大成果，已成為新藥開(kāi)發(fā)的主要方向之一。
泛素化的具體過(guò)程
泛素化修飾涉及泛素激活酶E1、泛素結(jié)合酶E2和泛素連接酶E3的一系列反應(yīng)：
在ATP供能的情況下E1粘附在泛素分子尾部活化泛素分子生成Ub-E1復(fù)合體，E1將激活的泛素分子轉(zhuǎn)移到E2酶上形成Ub-E2復(fù)合體。隨后，E2酶和一些種類(lèi)不同的E3酶共同識(shí)別靶蛋白，對(duì)其進(jìn)行泛素化修飾。根據(jù)E3與靶蛋白的相對(duì)比例可以將靶蛋白單泛素化修飾和多聚泛素化修飾。
泛素化過(guò)程(Stone, Sophia L., 2019)
E1：泛素激活酶E1;E2：泛素偶聯(lián)酶E2;E3：泛素連接酶E3;
Target：靶蛋白;Ubiquitin：泛素;DUBs：去泛素化酶。
P.S.單個(gè)泛素分子以其C-末端賴(lài)氨酸與靶蛋白的一個(gè)Lys側(cè)鏈相連叫做單泛素化，與多個(gè)賴(lài)氨酸殘基相連叫做多泛素化。如果靶蛋白的單個(gè)Lys殘基被多個(gè)泛素分子標(biāo)記則稱(chēng)為多聚泛素化。
簡(jiǎn)而言之，也就是在E1、E2、E3三類(lèi)酶的順序催化下，泛素被以特異性的方式連接到靶標(biāo)蛋白質(zhì)或靶標(biāo)蛋白質(zhì)上已連接的泛素鏈上，其中E3泛素化連接酶決定靶蛋白的特異性識(shí)別。蛋白質(zhì)泛素化的結(jié)果是使得被標(biāo)記的蛋白質(zhì)被蛋白酶分解為較小的多肽、氨基酸以及可以重復(fù)使用的泛素。
泛素化抗體的應(yīng)用
自泛素-蛋白酶體系統(tǒng)在20世紀(jì)80年代初被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，與其相關(guān)的研究成果層出不窮。泛素對(duì)細(xì)胞的生命活動(dòng)不可或缺，但由于泛素化的復(fù)雜性，人們目前的認(rèn)知也只是冰山一角，很多問(wèn)題仍有待研究。泛素化抗體適用于檢測(cè)不同形式的泛素，以幫助科研人員了解細(xì)胞在生命活動(dòng)中差異顯著的蛋白質(zhì)的性質(zhì)，研究這些變化的規(guī)律，可幫助科研人員準(zhǔn)確定位泛素化靶點(diǎn)和靶向相關(guān)疾病的治療。例如，診斷阿爾茨海默病(AD)的神經(jīng)原纖維纏結(jié)和成對(duì)螺旋絲，帕金森病中的路易小體，以及尼曼-匹克病中的匹克小體都是高度泛素化的，可以很容易地用泛素抗體檢測(cè)到。
如何檢測(cè)蛋白是否泛素化
1、免疫沉淀反應(yīng)
通過(guò)免疫共沉淀方法分離特定蛋白質(zhì)及其結(jié)合蛋白(包括被泛素化修飾的蛋白)。分離出的蛋白經(jīng)SDS電泳后用泛素抗體進(jìn)行western blot分析，可以鑒定具體哪個(gè)蛋白發(fā)生了泛素化修飾以初步判斷某蛋白具有泛素化功能。
2、體外泛素標(biāo)記突變位點(diǎn)
將研究蛋白(被泛素化的蛋白)通過(guò)蛋白提取試劑盒提取內(nèi)源性蛋白或通過(guò)基因工程技術(shù)重組表達(dá)后提純。用k63或k48連接的泛素鏈肽段系列酶E1、E2、E3在適當(dāng)條件下體外孵育，然后用泛素抗體進(jìn)行western blot分析。該方法可以明確所研究蛋白的哪個(gè)賴(lài)氨酸殘基容易發(fā)生泛素化。
3、體外泛素化實(shí)驗(yàn)
將待研究蛋白A(被泛素化的蛋白)與UBE1，Ubc13和UBE2V2 complex，Tag-ubiquitin以及待研究的蛋白B(具有泛素連接酶E3活性)在體外反應(yīng)緩沖液中共同進(jìn)行孵育。將孵育后的產(chǎn)物進(jìn)行IP和WB分析。該方法可以明確B蛋白具有E3連接酶活性且是引起A蛋白發(fā)生泛素化修飾的關(guān)鍵因素。
普健生物除可進(jìn)行常規(guī)的單抗、多抗制備外，還可定制如磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化等修飾性抗體，抗體制備經(jīng)驗(yàn)豐富，抗體發(fā)現(xiàn)平臺(tái)完善。
