聯(lián)系我們
糖基化修飾在藥物蛋白功能、穩(wěn)定性及血漿半衰期等方面起到重要作用。真核生物中糖基化修飾蛋白在維持蛋白穩(wěn)定、細胞信號轉導、免疫調控、細胞間的互作、細菌-宿主識別互作等過程中發(fā)揮著重要功能。
N-糖基化修飾是蛋白糖修飾的主要方式之一，寡糖通過與新生肽鏈中特定天冬酰胺的酰胺氮連接。在原核生物中也廣泛存在寡糖合成途徑與 N-糖基化修飾蛋白質機制，形成病原菌外膜上的脂寡糖。脂寡糖在病原菌黏附和宿主細胞侵入、逃避宿主免疫防御中發(fā)揮重要作用。
大腸埃希菌是人體不可缺少單細胞生物。大腸埃希菌，俗名大腸桿菌（革蘭氏陰性短桿菌），周身鞭毛，能運動，無芽。是人和動物腸道中的正常棲居菌。
2002 年，瑞士聯(lián)邦理工學院Wacker 等研究人員首次將空腸彎曲桿菌( Campylobacter jejuni) N-糖基化基因簇( pgl) 轉入大腸桿菌，成功地在大腸桿菌工程菌株中N-糖基化修飾外源蛋白質，開創(chuàng)了利用大腸桿菌 N-糖基化修飾重組蛋白新紀元。近 20 年間，人們利用不同來源的糖基化轉移酶、寡糖轉移酶，在大腸桿菌中開展類人源和人源化 N-糖基化重組蛋白、病原菌寡糖的糖疫苗制備研究。
利用大腸桿菌表達系統(tǒng)制備N-糖基化重組蛋白的機制
天然原核生物 N-糖基化修飾系統(tǒng)主要由4個必要元件組成:糖基化識別序列、糖基轉移酶
(glycosyl transferase，GT) 、糖苷酶、糖底物供體，它們分別負責接受、添加、修剪和提供底物以合成寡糖，并進一步通過依賴寡糖轉移酶( oligosaccharyl transferase，OST) /非依賴 OST的途徑將寡糖轉移到靶蛋白上。將以上機制轉移到大腸桿菌中，實現(xiàn) N-糖基化重組蛋白，可重塑合成寡糖鏈及重組蛋白修飾，將在糖疫苗生產、糖基化修飾藥物蛋白等方面具有巨大應用潛力。
Schematic diagram of the main mechanism of N-glycosylated recombinant protein production via Escherichia coli
A: OST-dependent N-glycosylation system; B: OST-independent N-glycosylation system
應用大腸桿菌表達系統(tǒng)制備N-糖基化重組蛋白
利用大腸桿菌表達系統(tǒng)生產糖基化基因工程抗體等重組蛋白及糖疫苗是目前熱點研究方向。自2012 年Aebi課題組首次利用大腸桿菌實現(xiàn)類人源化糖鏈Man3GlcNAc2核心五糖 N-糖基化修飾重組蛋白后，利用多種原核生物進行糖基化修飾的技術一直在不斷探索中，其技術核心是將其他原核生物來源的寡糖轉移酶（識別并將寡糖轉移到重組蛋白上的糖基化識別序列上）和多種糖基轉移酶（非模板驅動合成寡糖）在大腸桿菌中共表達，完成寡糖合成及 N-糖基化定點修飾蛋白基本過程。
近幾年研究結果表明該系統(tǒng)可以實現(xiàn)定點（識別特異氨基酸序列）、均質性（糖鏈微觀均質、糖蛋白宏觀均質）修飾重組蛋白，這是真核系統(tǒng)無法比擬的優(yōu)勢。真核細胞合成的聚糖性質較其他合成途徑而言與人的更為相似（如圖）。但是，天然真核細胞表達系統(tǒng)糖表位修飾N-糖基化重組蛋白的均質性很低，這種異質性源于哺乳動物復合型N-多糖合成的多步驟過程。
Schematic diagram of antibody glycosylation modification in eukaryotic cells
普健生物擁有十余年的蛋白表達經驗，經過不斷的探索和改進，開發(fā)了建立了3H（High through、High efficiency、High quality）大腸桿菌表達系統(tǒng)，擁有獨特的表達純化及復性平臺，95%以上的超高蛋白表達成功率，已成功交付上萬例大腸桿菌表達服務項目。如果您有大腸桿菌重組蛋白表達與純化項目需求，歡迎聯(lián)系027-87001869與我們的專員進行溝通！
Schematic diagram of the production of N-glycosylated recombinant proteins using Escherichia coli
A: Ｒecombinant protein pathway modified by N-glycosylation in Escherichia coli; B: Cell-free glycoprotein synthesis pathway
O-糖基化修飾可以增加治療性蛋白的穩(wěn)定性和體內循環(huán)時間。雖然糖基化修飾對每種蛋白質的影響可能不同，但研究顯示N-糖基化修飾可通過以下方式改善蛋白的理化性質:
①通過屏蔽非結構化、疏水性或易于蛋白酶作用的蛋白質區(qū)域來防止變性、聚集和降解；
②增加分子的分子量和流體動力學半徑以減少腎濾過；
③去除免疫原性，減少免疫系統(tǒng)清除；
④覆蓋或去除可被人凝集素識別/清除的末端結構。
目前，利用大腸埃希菌解決了均質性修飾N-糖基化修飾重組蛋白問題。該技術有望首先在糖疫苗生產方面得到產業(yè)化應用。
參考文獻
[1]Wacker M,Linton D,Hitchen PG,et al.N-Linked glycosylation in Campylobacter jejuni and its functional transfer into E.Coli[J].Science,2002,298( 5599) : 1790-1793．
[2]Kightlinger W,Warfel KF,Delisa MP,et al.Synthetic glycobiology: Parts,systems,and applications[J]. ACS Synthetic Biology,2020,9(7) : 1534-1562．
[3]Pratama F,Linton D,Dixon N.Genetic and process engineering strategies for enhanced recombinant N-glycoprotein production in bacteria[J].Microbial Cell Factories,2021,20( 1) : 198．
[4]Terra VS,Mauri M,Sannasiddappa TH,et al.PglB function and glycosylation efficiency is temperature dependent when the pgl locus is integrated in the Escherichia coli chromosome[J].Microbial Cell Factories,2022,21( 1) : 6.
[5]Marshall LE,Nelson M,Davies CH,et al.An O-antigen glycoconjugate vaccine produced using protein glycan coupling technology is protective in an inhalational rat model of tularemia[J].Journal of Immunology Ｒesearch,2018,2018: 8087916．
[6]Cuccui J,Thomas RM,Moule MG,et al.Exploitation of bacterial N-Linked glycosylation to develop a novel recombinant glycoconjugate vaccine against Francisella tularensis[J].Open Biology,2013,3( 5) : 130002.
